和记娱乐中国创新中心与张家口市食品药品检验中心合作，通过在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱仪Nexera UC（Online SFE-SFC-MS/MS），开发水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的测定方法，为Nexera UC在水产品自动化分析的应用提供了参考。
背景介绍
孔雀石绿（Malachite Green，MG）和结晶紫（Gentian violet，GV）均为人工合成的有机化合物,属于三苯甲烷型染料，同时也是杀菌和杀寄生虫的化ꦉ学制剂，常用于鱼类水霉病等寄生虫病的防治，或作为消毒剂用于鲜活鱼类运输过程中，以延长鱼类的存活时间。孔雀石绿和结晶紫在生物体内分别代谢为隐性孔雀石⛦绿和隐性结晶紫。这些化合物具有高残留、高毒性、高致畸和高致癌性，对人们的健康构成了潜在的巨大威胁，我国自2005年已将其列入禁用目录中。
孔雀石绿（Malachite Green，MG）
结晶紫（Gentian violet，GV）
目前国标中检测方法主要有高效液相色谱法、荧光色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等，但前处理方法繁琐。本方法采用在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法（Online SFE-SFC-MS/MS），对水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的残留量进行测定，样品只需简单粉碎后加入脱水剂即可直接上机，进行超临界流体萃取、经超临界流体色谱分离和质谱检测。与传统检验方法相比较，Online SFE-SFC-MS/MS法将以往样品前处理以及分析检测的数小时，缩短到现在全流程仅需要30分钟，该方法具有简单、快速、安全、准确等优点。
在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱仪Nexera UC
实验方法
（1）萃取条件：
萃取剂：A为超临界CO2，B为含0.1%甲酸的甲醇。萃取剂比例：（95：5，V/V）。萃取流速：3 𓃲mL/ min。萃取温度：40℃。萃取时背压A为15 MPa，背压B为14.8 M♋Pa。采取先静态萃取4 min，再动态萃取3 min的方式进行萃取。
（2）色谱条件：
色谱柱：Shim-pack UC-X RP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)。
流动相：A为超临界CO2，B为含0.1%甲酸𒀰的甲醇。流速：2 mL/ min。柱温：40℃。采用5%B (7 min)- 30%B(10-15 min)- 5%B(15💟.1-17 min)梯度洗脱程序。洗脱时背压A为15 MPa，背压B为40 MPa。
（3）质谱条件：
正ℱ离子检测模式；离子源：ESI源。离子源温度：400 ℃。脱溶剂管温度：200 ℃。加热模块温度：400 ℃。雾化气流量：3 L/min。加热气流量：15 L/min。干燥气流量：5 L/min。
结果与讨论
（1）线性和定量限
配制系列标准曲线工作液（10ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL、160 ng/mL、200 ng/mL），以超临界流体萃取专用空白滤纸片为基质，将混合标准溶液和内标溶液加在滤纸上，并放入5mL规格超临界流体萃取装置的萃取罐中，按照本试验选取的超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件进行测定。以峰面积为纵坐标，标准品质量（ng）为横坐标，进行线性回归，得到各组分的回归方程及相关系数，见表1。结果显示该方法在试验范围内线性ꦰ关系良好。
表1 各组分线性关系测定结果
以空白虾肉样品为基质，称取1.0♉g，将标准品溶液和内标混合溶液加入空白基质，混匀后，进行测定，记录峰面积，在信噪比S/N约为10时测得最低检测浓度为0.5μg/kg，即定量限为0.5μg/kg。
图1 Onliཧne S✅FE-SFC-MS/MS分析水产品中孔雀石绿和结晶紫色谱图（0.5μg/kg）
（2）回收率与精密度
分别以空白虾肉和空白鱼肉基质，各称取1.0g，加入不同浓度水平的标准品溶液及内标混合液，按照本试验选取的超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件提取测定，将峰面积代入回归方程计算加标回收率𒊎。结果在0♍.5ng/g～5ng/g的加标范围内，水产品中孔雀石绿、结晶紫、隐形孔雀石绿、隐性结晶紫的回收率范围分别为80.28%～108.21%、89.02%～110.46%、80.19%～110.36%、85.22%～109.38%，RSD值范围分别为5.3%～7.1%、4.9%～7.9%、5.2%～8.9%、5.7%～6.6%。
结论
通过使用在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法，可实现水产品中孔🐽雀石绿、结晶紫及其代谢物的残留量的快速自动化检测，该方法不仅简化了样品前处理操作，节省了分析时间，而且也是一种绿色环保的检测技术。