流动相pH值在蛋白质/分析中的重要性不言而喻
生物药需要对从开发到运输的每个过程进行适当的质量控制，这增加了提高分析可靠性和数据可追溯性的重要性。在液相色谱分析中由于蛋白质和脑的结构中有许多可解离基团流动相的pH值会影响高效液相色谱分析中的峰分离。因此，⭕pH值在优化分析条件时起着至关重要的作用。
为什么需要在线实时监测流动相的pH值?
通常，流动相的pH值只在流动相配制过程中进行检查，但是却忽视了分析期间pH值的变化可能会对分析性能(如分离度和重现性) 产生负面影响，特别♉是在长时间连续分析的情形下。另外，pH值数据可追溯性也很重要，能在分析结果不佳的原因和研判分析ꦏ方法过程中提供至关重要的信息。
实时监控pH值变化并提供随时可追溯的结果
和记娱乐流动相pH监测器pHM-40可以嵌合在色谱系统中 (图1)，实时记录pH值的变化。pH值信息与所有其他分析信息 (如分析条件、色谱图和定量参数)一起自动存储在数据文件中，通过LabSolutions 软件在色谱数据文件中随时调用管理pH曲线，确保数据的可追溯性和可靠性。宽pH范围 (1至14) 提供了pHM-40在各种应用中使用的可能性。
图1 ：配置了pH监测器的液相色谱系统流路图
应用案例1：优化单克隆抗体聚集体分析中的流动相pH值
抗体药物中的聚集🦂体和片段等杂质分析通常使用ܫ体积排阻色谱法 (SEC)。在体积排阻色谱中，流动相pH可以改变单体、聚集体和片段的电荷状态，从而改变色谱分离行为。
在本应用中，考察流动相pH值从5.7到7.2时分离状态变化，分析过程中的pH值由pHM-40确认并叠加关联至色谱图，可直观地确定理想分离状态的pH值🌜 (图2、图3)
| 表1分析条件 | |
|---|---|
| 系统 | Nexera XS inert生物惰性超高效液相色谱 |
| 色谱柱 | Shim-packTm Bio Diol-300 (150 mm x 4.6 mm l.D., 2 um) |
| 流动相 (自动混合) |
A:200mmol/L磷酸钠缓冲液 B:200mmol/L磷酸二钠缓冲液 C:1 mol/L 氯化钠溶液 D:水 |
| 流速 | 0.25 mL/min |
| 柱温 | 25℃ |
| 样品 | 单克隆抗体标准品(500 ug/mL) |
| 进样体积 | 5 uL |
| 检测器 | 280 nm(SPD-M40惰性流通池) |
图2 pH=7.2时的色谱图
图3 不同pH值时色谱图的变化 (放大)
应用案例2：监控抗体电荷异构体分析中的pH值梯度变化
抗体药物中的电荷异构体分析常使用离子交换色谱法。本案例为在西妥昔单抗生物类似药的电荷异构体分析过程中，使用pHM-40进行pH值梯度监控的应用。使用具有不同缓冲能力的HEPES，MES和🦂乙酸钠溶液等调节pH值，可观察到PH值随流动相B相浓度的增加而从PH5.5线性变化至pH 8.0左右。将流动相浓度🎃恢复到初始浓度后，色谱图降至基线水平 (约18分钟)，pH值恢复到初始值。
(时间差是色谱柱根据流动相pH值的变化达到平ꦜ衡后，流动相从检测器到达pH监测器所需的时间)测得的pH值可用于准确估算色谱柱平衡时间。
| 表2分析条件 | |
|---|---|
| 系统 | Nexera XS inert生物惰性超高效液相色谱 |
| 色谱柱 | Shim-pack Bio IEX SP-NP ( 100 mm x 4.6 mm l.D., 3 um) |
| 流动相 | A: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 5.0) B: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 8.2) |
| 梯度程序 | B Conc.0%(0-0.5 min) - 100%(0.5-10 min) - 0%(15.1-25 min) |
| 流速 | 0.6 mL/min |
| 柱温 | 25℃ |
| 样品 | 西妥昔单抗生物类似药(1 mg/mL) |
| 进样体积 | 5 uL |
| 检测器 | 280 nm(SPD-M40,惰性流通池) |
图4 西妥昔单抗色谱图 (含流动相浓度梯度曲线和pH曲线
总结
1）蛋白质和脑的分析，很容易受到流动相pH值的影响，因此有必要在分析过程中监测流动相pH值。
2）pH曲线可以很容易地叠加在色谱图上，使所得数据文件更加完整，并提高数据的可追溯性和可靠性。