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临床研究新秘籍 I 揭秘和记娱乐磁珠法“大小兼备”解决方案！

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导语

　　磁珠法是一种使用生物磁珠对临床样品进行前处理的方法，它具有良好的自动化前景，且应用基础可靠，是目前的研究热点。

　　在核酸检测领域，基于磁珠法的全自动核酸提取仪已广泛普及，在新冠病毒流行期间更是为病毒核酸的提取贡献了巨大力量；在细胞生物学领域，基于免疫磁珠法的细胞分选方法已得到国际认可；人体内的小分子代谢物（如维生素）、激素（如睾酮）等物质的磁珠法提取检测方案已备受关注。此外，针对大分子蛋白质类物质的免疫亲和纯化磁珠法提取具备良好的发展前景，并将为定量蛋白质组学提供强有力的工具，但目前报道较少。和记娱乐磁珠法“大小兼备”解决方案：引领临床研究全新前处理方式！

磁珠

　　和记娱乐始终致力于前沿方向的应用和研究，使用磁珠法建立了“大小兼备”，即“大”-针对蛋白质类大分子生物标志物及“小”-针对小分子化合物的质谱检测方案，积极推进磁珠法在临床研究中的应用进度。

　　本文将带您详细了解磁珠法，以及和记娱乐“大小兼备”解决方案。

　　

什么是生物磁珠?

 

　　生物磁珠是指具有微纳米尺寸粒径的超顺磁性微球。单个磁珠颗粒的粒径通常在亚微米到微米（0.1 μm – 100 μm）范围内。它具有超强的顺磁性，在外加磁场作用下能够迅速聚集，离开磁场后能够回归初始状态而均匀分散于介质中。此外，它的表面还具有丰富的活性基团，用于和生化物质偶联，从而实现待测物的提取和样品分离。

　　典型的核-壳结构磁珠如下图所示，磁性内核主要由纯金属（铁、钴、镍等）或其氧化物组成；高分子涂层一般为氧化硅或聚合物，功能基层则是选择性进行基团修饰，从而实现不同的目的。除此之外，还有夹层式结构和弥散型结构。

高分子

　　

磁性固相萃取技术（M-SPE）

 

　　磁性固相萃取技术是基于液-固色谱理论，以磁性或可磁化的材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术。在该技术中，磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中，而是被添加到样品的溶液或者悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面；在外部磁场作用下，目标分析物随吸附剂一起迁移，最终通过合适的溶剂洗脱被测物质，从而与样品的基质分离开来。

萃取

　　基于氧化硅及其键合相的固相萃取材料使用最为广泛。未修饰的氧化硅表面具有大量的硅羟基。键合不同基团的氧化硅可以用作反相、离子交换、亲水、疏水以及复合模式的固相萃取材料。除了氧化硅以外，还有聚合物系列固相萃取材料。

M-SPE与传统SPE方法的特点比较

方法

　　

用于免疫亲和纯化的磁珠

 

　　除了以上介绍的磁珠键合相之外，磁珠表面还可键合其他基团，从而能够与抗体进行偶联，通过免疫亲和反应对基质中的大分子生物标志物进行提纯。

　　常见的键合基团为对-甲苯-磺酰基（Tosyl）基团，该基团能够与抗体中的伯胺（NH2）或巯基（SH）基团共价结合，形成的磁珠-抗体复合物可用于待测物的提纯。

　　此外，在磁珠表面键合链霉亲和素后，能够特异、高效地结合生物素化的抗体，最大程度减少非特异性反应。

　　

和记娱乐磁珠法“大小兼备”解决方案

 

　　“小”：M-SPE用于血清中5种脂溶性维生素的质谱检测方法

　　本方案使用键合非极性基团的磁珠及自动化前处理设备（南京艾迪迈科技有限公司）对血清进行前处理，并在LCMS-8050上建立了5种脂溶性维生素的同时分析方法。

　　前处理设备外观、内部结构及上机深孔板设置见下图。使用该设备前处理效率高，12分钟可以完成32个测试处理，无需氮吹和离心处理。

检测

　　使用前处理设备进行自动前处理，样品经过磁珠吸附、萃取、淋洗和洗脱后得到样品溶液，取100 μL样品溶液加入20 μL水涡旋混匀后上机测试。

性能

　　对方法学性能进行考察，定量下限处色谱图峰形良好，灵敏度高，通道无干扰。

  • 方法学 VA(20 ng/mL)
  • 方法学 25-OHVD2(2 ng/mL)
  • 方法学 25-OHVD3(3 ng/mL)

　　

  • 方法 VE(200 ng/mL)
  • 方法 VK1(0.30 ng/mL)

　　

　　在线性范围内，5种脂溶性维生素相关系数r＞0.99，线性关系良好。

维生素

　　使用低、中、高三浓度水平质控品进行准确度与精密度考察，结果显示5种脂溶性维生素的准确度在85.0%-107.8%之间，精密度RSD（n=3）在0.94%-13.6%之间，方法性能良好。

　　“大”：磁珠法用于血清中C反应蛋白的质谱定量分析方法

　　C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是存在于血清中的，由肝脏细胞合成的最强的急性期反应蛋白之一。它在炎症评估、心血管疾病风险预测、自身免疫疾病评估、癌症的预测、术后监测等方面都具有重要的指示意义。

　　本方案使用磁珠与C反应蛋白单抗进行偶联，制得磁珠-单抗复合物后对血清中的C反应蛋白进行提纯。之后经过蛋白的变性、还原、烷基化，使用胰蛋白酶进行酶切，酶切产物经过SPE纯化和浓缩，使用LCMS-8060NX对特征肽段进行检测。

磁珠

　　经过磁珠的提纯，血清中杂质被除去。定量下限处色谱图峰型良好，灵敏度高，无干扰。

  • 灵敏度
    AFVFPK（0.25 μg/mL）
  • 灵敏度
    ESDTSYVSLK（0.5 μg/mL）

　　

　　在线性范围内，两条特征肽段的相关系数r＞0.995，线性关系良好。

线性

　　使用低、中、高三浓度水平质控品进行准确度与精密度考察，结果显示两特征肽段的准确度在86.46%-113.55%之间，精密度RSD（n=3）在0.71%-7.22%之间，方法性能良好。

　　

【结语】

 

　　磁珠法在临床研究中的应用前景广泛。在小分子物质检测领域，磁珠法操作简便，方法性能可靠，相较于传统萃取方法自动化程度更高；在大分子生物标志物检测领域，基于免疫亲和纯化的磁珠法前处理能够大幅度减少基质带来的干扰，为建立质谱定量分析方法提供条件。和记娱乐磁珠法“大小兼备”解决方案为以上两类物质的检测提供了参考。

　　和记娱乐作为业界著名的分析仪器厂商，一直秉承“为了人类和地球的健康”这一理念。未来和记娱乐将继续为用户提供更多更丰富的方案及服务，欢迎持续关注！