导读

　　血友病是一种遗传性疾病，患者可能因为轻微碰撞，就会流血不止，严重时将危及生命，其病因是缺少凝血因子。人凝血因子VIII就是一种重要的凝血因子，是一种由血管内皮细胞合成并分泌入血的蛋白质，缺乏将导致甲型血友病。目前血友病的治疗以替代疗法为主，就是常说的“缺啥补啥”，即向患者体内输注缺少的凝血因子来帮助止血，可以说凝血因子是血友病患者的“救命药”。

　　人凝血因子VIII产品可由人血浆中分离提取或经基因重组技术生产。我国临床上主要使用的是人血浆来源产品，其成分较为复杂，除人凝血因子Ⅷ外，还可能含有多种血浆蛋白、肝素钠、聚乙二醇 3350、聚山梨酯80、氨基酸、磷酸三丁酯等诸多成分。其中聚乙二醇和聚山梨酯80为生产中用到的试剂，前者用于分离纯化，后者用于病毒灭活，需要监控其在终产品中的残留量。

　　人凝血因子VIII中聚合物杂质是怎么产生的呢？

　　人凝血因子VIII中主要有两种聚合物杂质，分别是聚乙二醇3350（又名PEG3350）和聚山梨酯80（又名吐温80）。

　　聚乙二醇3350是一种亲水性聚合物，广泛用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，也是人凝血因子VIII分离制备过程中的常用试剂。相关研究表明，聚乙二醇可能是一种半抗原，应进行质量控制。

　

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  聚乙二醇3350（PEG 3350）

  o亲水性聚合物

  o用于分离制备

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  聚山梨酯80（Tween 80）

  o非离子型表面活性剂

  o用于病毒灭活和增溶

 

　　聚山梨酯80是一种非离子型表面活性剂及乳化剂，广泛用作药物辅料。人血浆来源的人凝血因子VIII产品具有潜在病毒风险，为保证其安全性，需要进行病毒灭活。常用的病毒灭活工艺为有机溶剂/去污剂(S/D)处理法，即采用有机溶剂磷酸三丁酯和表面活性剂聚山梨酯80结合进行病毒灭活。为保证产品安全性和有效性，应在灭活后去除灭活试剂，并对其残留量进行检测和监控。《中国药典（2020年版）》对聚山梨酯80的残留量要求是不高于100 μg/mL。

　　人凝血因子VIII中聚合物杂质怎么测?

　　《中国药典（2020年版）》第三部人凝血因子Ⅷ检定项下，聚乙二醇和聚山梨酯80残留量的测定，分别依照通则3202和通则3203，采用紫外分光光度计法进行测定。该方法选择性低，容易受到共存物干扰。

　　另一种聚合物分析常用方法是尺寸排阻色谱法，由于聚山梨酯80、聚乙二醇3350、肝素钠等聚合物分子量分布存在交叠，难以分离，影响定量准确性。

　　因此，开发一种选择性好，准确度高的分析方法进行聚合物杂质的分析，很有必要。

　　- 和记娱乐解决方案 -

　　和记娱乐开发了一种液相色谱仪结合蒸发光散射检测器ELSD-LT Ⅲ检测人凝血因子Ⅷ中聚合物残留的分析新方法。聚乙二醇3350和聚山梨酯80均无紫外吸收，使用ELSD-LT Ⅲ既可实现高灵敏度的定量测定，又可通过梯度洗脱改善分离，有效避免人凝血因子Ⅷ中复杂共存物的干扰。

　　分析仪器

和记娱乐Nexera LC-40液相色谱仪+蒸发光散射检测器ELSD-LT Ⅲ

　　方法学结果

　　使用外标法绘制校准曲线，聚乙二醇3350和聚山梨酯80相关系数大于0.998，回读值准确度在90.9~109.3%之间，线性良好；校准曲线低浓度六次连续进样的峰面积RSD不大于3%，精密度良好；校准曲线低浓度下的加标回收率在93.2~103.6%之间，准确可靠。

图1. 聚乙二醇3350色谱图（左，50 mg/L）和校准曲线（右）

图2. 聚山梨酯80色谱图（左，10 mg/L）和校准曲线（右）

表1. 方法学结果

　　实际样品分析

　　人凝血因子VIII复溶液高速离心后上机分析，样品中未检出聚乙二醇3350，检出聚山梨酯80，含量为38.9 mg/L。

图3 人凝血因子Ⅷ样品色谱图

　　

　　结语

　　血友病患者因为先天基因突变导致体内凝血因子不足，通常需要终身注射补充凝血因子。考虑到临床长期用药的特点，凝血因子类产品的安全性尤为重要。聚乙二醇3350和聚山梨酯80是人凝血因子Ⅷ生产中的重要试剂，但都有潜在不安全性的特点。因此，准确测定人凝血因子Ⅷ产品中聚合物杂质残留量，保证其在安全限度内，十分必要。液相色谱仪结合蒸发光散射检测器ELSD-LT Ⅲ进行聚合物杂质残留量测定，可有效避免人凝血因子Ⅷ产品中复杂共存物干扰，灵敏、准确、前处理简单，让血友病“救命药”更安全，患者用药更安心。